1952年，还在念初中的祝希娟参演了由赵丹执导的剧情电影《为孩子们祝福》。1957年，祝希娟考入上海戏剧学院表演系。1960年，从学校毕业后担任了上海戏剧学院实验话剧团、上海青年话剧团的演员  。

1961年，与王心刚合作主演战争电影《红色娘子军》，在片中饰演性格顽强、泼辣、勇敢、朴实的吴琼花  ，她凭借该片获得首届大众电影百花奖最佳女演员奖  。

1962年，与王尚信、王熙岩联合主演剧情电影《燎原》  ；同年，祝希娟被中国文化部评为中国电影二十二大影星  。1964年，与赵丹、高博联合主演剧情电影《青山恋》。1974年，与王志刚、娄际成联袂主演剧情电影《无影灯下颂银针》，该片根据上海市胸科医院业余文艺创作组的同名话剧改编  。

1979年，与张勇手搭档主演改编自真实事件的剧情电影《啊！摇篮》，在片中饰演骁勇善战、倔强冷静且做事雷厉风行的李楠  。1981年，与李家耀合作主演剧情电影《模范丈夫》  ；同年，与宋玉华等共同主演话剧《再见了，巴黎》。

1983年，担任深圳电视台副台长兼深圳电视艺术中心主任，并成为了该台第一位节目主持人。1985年，策划推出反映深圳2万名工程兵的剧情电影《男性公民》  。1987年，凭借主演的话剧《裂变》获得第2届广东艺术节表演一等奖。

1988年，编剧并主演了深圳特区记录片《迷人的年轻城》  。1989年，祝希娟担任深圳电视台电视艺术中心主任；8月19日，由其出演的剧情电影《最后的贵族》上映，该片改编自白先勇的短篇小说《谪仙记》。1991年，凭借电视剧《法人代表》获得第5届中南区电视剧金帆奖优秀女演员奖。

1996年8月，祝希娟开始向美国进军，她率领深圳电视艺术中心摄制组前往洛杉矶与美国上海洛杉矶娱乐公司合作，并参演了电视剧《百老汇100号》，该剧以剧中人林贝贝的自述形式展开。1997年，与葛优、陈道明共同主演古装剧《寇老西儿》  。

1998年9月，祝希娟退休后告别深圳，与侯烽民一起到美国洛杉矶定居，后来与好友连手创办了“美国琼花影视艺术公司”，祝希娟担任总裁；同年，与杨绍林共同主演军事剧《魂系哈军工》。2001年，在刘佳、侯天来主演的都市剧《再婚家庭》中饰演白如雪母亲  。

2002年，出演喜剧电影《送你送到小城外》  。2003年，与孙思瀚、伍宇娟联袂主演刑侦剧《忠诚卫士》。2004年，由其参演的亲情剧《亲情树》首播  。2005年，与柳云龙共同出演谍战剧《暗算》，该剧改编自麦家的同名小说  。2006年，出演以养老院为背景的剧情电影《老人的故事》  。

2007年，与刘小锋、董璇联合出演剧情电影《七彩马拉松》  ；1月8日，与陈宝国、黄志忠联合参演的古装剧《大明王朝1566嘉靖与海瑞》播出  ；8月，参演的都市亲情剧《女高男低》播出，在剧中饰演秦红梅的母亲  ；同年，与杨昆、张秋歌联合出演根据真人真事改编的电视剧 《天经地义》  。

2008年，与李雪健、高明联合出演都市生活剧《命运》  ；同年，与戚迹共同主演古装剧《根在中原》  。2009年，担任剧情电影《滑向未来》的制作人。2011年，参演由朱传光执导的都市剧《男人不坏》；同年，与石安妮共同主演爱情剧《红色恋歌》  。

2012年，与张歆艺、李光洁共同主演都市剧《绝爱》，该剧根据网络小说《第三种爱情》改编  ；5月8日，与许还山、吴天明联合出演喜剧电影《飞越老人院》  ；8月，与竹妹子合作主演音乐电影《井冈恋歌》  ；10月26日，由其出演的都市爱情电影《三个未婚妈妈》上映  ；12月，由其参演的儿童励志电影《寻找成龙》上映，在片中饰演张一山的奶奶  。

2013年，出演根据申纪兰真人真事改编的传记电影《申纪兰》  。2016年，与刘敏涛、刘佩琦联合出演当代乡村剧《守婚》  。2017年，领衔主演文艺电影《大雪冬至》  ，她凭借该片入围第9届澳门国际电影节最佳女主角奖  ，获得第20届上海国际电影节电影频道传媒关注单元评委会特别荣誉奖  ；9月，祝希娟获得第16届中国电影表演艺术学会金凤凰奖特别荣誉奖  ；11月，祝希娟获得第27届中国金鸡百花电影节终身成就奖  ；12月，祝希娟获得第9届澳门国际电影节华语电影终身成就奖  。

2018年，由其参演的战争电影《浴血广昌》上映，该片由真实历史事件改编  ；同年，出演由赵晨阳执导的都市剧《我的健身教练》  ；9月3日，由其参演的剧情电影《那些女人》上映  。

2020年，领衔主演由张唯执导的剧情电影《空巢》，该片讲述了一位老教师和外来务工小伙子的故事  ；9月，获得新时代国际电影节庆祝新中国成立70周年全国十佳电影女演员奖  。

2021年7月16日，友情出演的打拐题材正能量电影《天下无拐》全国上映  。