1981年，顾长卫与北京电影学院1978级学生联合拍摄了电影《我们的田野》。1982年，顾长卫从北京电影学院摄影系毕业，被分配到西安电影制片厂做摄影助理。1983年，担任爱情电影《结婚》的摄影师。

1984年，担任剧情电影《海滩》的摄影师，该片由滕文骥执导，讲述了关于海滩上渔民们的故事。1986年，掌镜张子恩执导的古装武侠电影《神鞭》。

1987年，掌镜陈凯歌执导的剧情电影《孩子王》；同年，在张艺谋执导的剧情电影《红高粱》中，顾长卫担任了摄影师。1988年，凭借电影《孩子王》、《红高粱》获得了第8届中国电影金鸡奖最佳摄影奖。

1989年11月21日，由张艺谋、杨凤良执导的剧情电影《代号美洲豹》上映，顾长卫在片中担任了摄影师。1990年，担任剧情电影《菊豆》的摄影师，该片改编自刘恒的小说《伏羲伏羲》，他则获得了第8届美国夏威夷国际电影节柯达摄影奖。

1993年1月1日，由张国荣、巩俐、张丰毅领衔主演的爱情电影《霸王别姬》上映，顾长卫在片中担任了摄影师，他则凭借该片获得了第66届奥斯卡金像奖最佳摄影的提名；同年，掌镜文隽、周晓文执导的剧情电影《狭路英豪》。

1995年9月1日，由姜文执导，夏雨、宁静、陶虹、耿乐主演的剧情电影《阳光灿烂的日子》上映，顾长卫在片中担任了摄影师，他则凭借该片获得了第33届台湾电影金马奖最佳摄影奖。1996年，担任系列专题片《知识改变命运》的导演及摄像指导。1997年8月7日，其掌镜的剧情电影《兰陵王》上映，他则获得了第15届夏威夷国际电影节最佳摄影奖。

1998年1月23日，其掌镜的惊悚电影《迷色布局》首映。1999年，参演张元执导、李阳主演的纪录片《疯狂英语》。

2000年5月12日，由姜文、姜鸿波、香川照之主演的战争电影《鬼子来了》上映，顾长卫在片中担任摄影师；8月11日，其掌镜的剧情电影《纽约的秋天》上映。

2005年2月18日，其执导的剧情电影《孔雀》上映，这是他执导的首部电影作品，该片由张静初、吕聿来、冯粒主演，该片获得了第55届柏林电影节评委会大奖，而他则获得了第6届华语电影传媒大奖最佳导演奖，并入围了最佳新导演奖。

2008年4月11日，由顾长卫执导，蒋雯丽、张瑶、李光洁联合主演的剧情电影《立春》上映。2010年，担任第82届奥斯卡金像奖评委。

2011年5月10日，其执导的剧情电影《最爱》首映，该片改编自阎连科的长篇小说《丁庄梦》，由章子怡、郭富城、陶泽如、濮存昕联袂主演，他则获得了第20届上海影评人奖最佳导演奖、第19届北京大学生电影节最佳导演奖；12月12日，获得年度时尚先生盛典时尚先生奖。

2012年，执导个人首部微电影《龙头》，该片由阎连科、杨薇薇、王嘉佳、任思鸿主演，以纪实手法从不同角度展现生与死这一命题，而他则获得了金考拉国际华语电影节最佳长片导演奖；11月，与华谊公司签订合同，正式入驻华谊。2013年4月，顾长卫担任第3届北京国际电影节的评委。

2014年12月24日，由顾长卫执导，陈赫、Angelababy、涂彦倪联合主演的都市爱情电影《微爱之渐入佳境》上映，该片首日票房达到了3500万元人民币，最终以2.84亿元人民币的票房成绩收官。2015年12月18日，出席第15届电影频道出品电影百合奖颁奖典礼。

2017年，执导爱情喜剧电影《遇见你真好》（原名《飞火流星》），并担任了该片的编剧，影片于2018年3月29日上映，由白客、蓝盈莹、曹骏、蒋易主演，这也是他加入北京首映时代后的第一部作品。